在” 如何進軍表觀遺傳學研究? 甲基化實驗方法總整理!” 這篇文章中，我們介紹了有哪些方法可以分析DNA甲基化。然而，在分析的過程中，很容易在PCR階段就卡關，而無法得到bisulfite target sequence (亞硫酸鹽反應後的標的序列)放大產物，到底是為什麼呢?
不得不說，亞硫酸鹽反應後的PCR實驗是整個甲基化分析中，最困難、失敗率最高的步驟。這是因為亞硫酸鹽反應會破壞DNA的結構，而使DNA序列碎裂化。因此，如果primer設計的位置剛好位於DNA碎裂化的斷點，則就有可能怎麼調整PCR protocol的參數都無法得到產物 !
影響bisulfite PCR的成功與否，除了primer設計因素以外，還有許多會影響成功率的眉眉角角，以下針對我們目前遇過的案例做個簡單的失敗因素統整：
- 樣本DNA品質
- 亞硫酸反應實驗
- Primer 設計
- PCR 條件
- 甲基化分析方法
上述五個階段都有各自需要留意的細節，本公司身為MassARRAY實驗服務的供應商，也時常遇到客戶委託的各種疑難雜症。甲基化實驗失敗的因素這麼多，要如何讓委託的老師了解並重新調整實驗，就必須仰賴專業的產品專員以及業務，向客戶進行多次的溝通與介紹，才能讓整個分析實驗順利結案。
在此我們就來為各位分享一個 “甲基化分析方法” 可能會影響實驗成功率的實際案例!
在推廣甲基化實驗服務時，有些客戶認為他們實驗室並不需要做到甲基化定量分析的程度，因此會採用成本較低的MSP-PCR甲基化定性分析實驗，來看結果是否符合預期。
(關於MSP-PCR的分析方法介紹，可以閱讀” 如何進軍表觀遺傳學研究? 甲基化實驗方法總整理!”懶人包)
不過，有時候學生參考了許多MSP-PCR文獻，卻都無法成功複製paper的經驗，進行實驗分析。我們曾經接過一個MSP-PCR怎麼做都無法成功的案例，後來客戶想試試看不同的分析技術，看能不能讓實驗出現轉機。
我們開始協助這個客戶，根據不同的基因序列，設計了不同片段大小的PCR target。並建議他們從大片段的primer做測試，依照設計結果報告中的Tm值開始找合適PCR條件。由於論文發表的時間緊迫，如果找不到適合的PCR program，就建議他們趕緊換成小片段的primer進行測試。
在進行PCR測試時，我們也不斷收取對方的跑膠結果，並提供各種實驗條件改動的建議。在多方協助之下，總算完成初步的實驗測試，並進行了大規模樣本的甲基化實驗分析。
為什麼MSP-PCR做不出來的實驗，改用MassARRAY分析方法就成功了呢?
首先，這兩種分析方法所設計的primer位置有很大的不同，MSP-PCR是直接將primer設計在CpG位點上，直接分析單點是否有甲基化或非甲基化的訊號；而MassARRAY則是設計在CpG site的前後，夾出想檢測的CpG island區域。
因此，MSP-PCR primer幾乎沒有改動的空間，如果想分析的位點序列很容易形成次級結構，則可能無論怎麼調整PCR條件，都很難成功進行分析。
MassARRAY分析甲基化，如果樣本原始DNA品質很好的話，最長可以分析600 bp的CpG island片段，因此primer 設計的自由度很高，如果挑選到合適的PCR區域，並成功得到PCR產物，就可以進行大規模的甲基化分析，樣本分析通量達到1000+例樣本以上!
後續我們會根據不同的失敗因子，分享各種甲基化分析的案例~
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作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員
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