如何進軍表觀遺傳學研究? 甲基化實驗方法總整理!這篇文章中,我們介紹了有哪些方法可以分析DNA甲基化。然而,在分析的過程中,很容易在PCR階段就卡關,而無法得到bisulfite target sequence (亞硫酸鹽反應後的標的序列)放大產物,到底是為什麼呢?

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不得不說,亞硫酸鹽反應後的PCR實驗是整個甲基化分析中,最困難、失敗率最高的步驟。這是因為亞硫酸鹽反應會破壞DNA的結構,而使DNA序列碎裂化。因此,如果primer設計的位置剛好位於DNA碎裂化的斷點,則就有可能怎麼調整PCR protocol的參數都無法得到產物 !

 

影響bisulfite PCR的成功與否,除了primer設計因素以外,還有許多會影響成功率的眉眉角角,以下針對我們目前遇過的案例做個簡單的失敗因素統整

  1. 樣本DNA品質
  2. 亞硫酸反應實驗
  3. Primer 設計
  4. PCR 條件
  5. 甲基化分析方法

 

上述五個階段都有各自需要留意的細節,本公司身為MassARRAY實驗服務的供應商,也時常遇到客戶委託的各種疑難雜症。甲基化實驗失敗的因素這麼多,要如何讓委託的老師了解並重新調整實驗,就必須仰賴專業的產品專員以及業務,向客戶進行多次的溝通與介紹,才能讓整個分析實驗順利結案。

 

在此我們就來為各位分享一個 甲基化分析方法可能會影響實驗成功率的實際案例!

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在推廣甲基化實驗服務時,有些客戶認為他們實驗室並不需要做到甲基化定量分析的程度,因此會採用成本較低的MSP-PCR甲基化定性分析實驗,來看結果是否符合預期。

(關於MSP-PCR的分析方法介紹,可以閱讀 如何進軍表觀遺傳學研究? 甲基化實驗方法總整理!懶人包)

 

不過,有時候學生參考了許多MSP-PCR文獻,卻都無法成功複製paper的經驗,進行實驗分析。我們曾經接過一個MSP-PCR怎麼做都無法成功的案例,後來客戶想試試看不同的分析技術,看能不能讓實驗出現轉機。

 

我們開始協助這個客戶,根據不同的基因序列,設計了不同片段大小的PCR target。並建議他們從大片段的primer做測試,依照設計結果報告中的Tm值開始找合適PCR條件。由於論文發表的時間緊迫,如果找不到適合的PCR program,就建議他們趕緊換成小片段的primer進行測試。

 

在進行PCR測試時,我們也不斷收取對方的跑膠結果,並提供各種實驗條件改動的建議。在多方協助之下,總算完成初步的實驗測試,並進行了大規模樣本的甲基化實驗分析。

 

為什麼MSP-PCR做不出來的實驗,改用MassARRAY分析方法就成功了呢?

 

首先,這兩種分析方法所設計的primer位置有很大的不同,MSP-PCR是直接將primer設計在CpG位點上,直接分析單點是否有甲基化或非甲基化的訊號;而MassARRAY則是設計在CpG site的前後,夾出想檢測的CpG island區域。

 

因此,MSP-PCR primer幾乎沒有改動的空間,如果想分析的位點序列很容易形成次級結構,則可能無論怎麼調整PCR條件,都很難成功進行分析。

 

MassARRAY分析甲基化,如果樣本原始DNA品質很好的話,最長可以分析600 bpCpG island片段,因此primer 設計的自由度很高,如果挑選到合適的PCR區域,並成功得到PCR產物,就可以進行大規模的甲基化分析,樣本分析通量達到1000+例樣本以上!

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後續我們會根據不同的失敗因子,分享各種甲基化分析的案例~


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作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員

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