癌症基因體學發展越來越快速,實驗研究和開發工具已陸續部署到臨床檢測中,且台灣也開始實行實驗室自行開發檢測技術LDTS認證規範。因此,了解這些檢測技術的再現性、敏感性和專一性,是通過品管認證不可或缺的必要條件。

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該如何達成認證所需的品管規範?

 

首先,擁有高品質、穩定的參考材料將是達成認證規範很大的助力。因為這些標準品可以設計在平常的檢測試驗流程中,協助確保數據的可信度,進一步釐清每個實驗步驟是否順利完成,成為臨床實驗室品保計劃中的一個重要的螺絲釘。

尤其是NGS檢測技術步驟非常繁雜,若要規劃NGS的臨床檢測項目,則必須要將陽性、陰性的標準品納入日常的檢測流程,以了解該批次實驗數據的品質是否符合品保標準。

 

NGS 標準品需要具有哪些特質?

高品質且實用的標準品主要有四大特質,分別為:

  • 製造、使用的再現性:這些標準品需要維持穩定性及實驗再現性,不應該隨時間、不同批號間或不同實驗之間而有所差異。
  • 臨床相關性:標準品的生物標記需要具有臨床相關性。
  • 適用不同實驗階段的品管品:具有multi-step controls功能的品管品可以協助確保不同步驟的實驗是否通過QC標準。舉例來說,其中一個品管品可以在核酸萃取之前進行實驗、一個可以在核酸萃取後接續實驗、也許還有一個可以加到NGS library中,以便了解定序品質和數據是否異常。
  • 適用不同技術:標準品需要適用於不同的基因檢測技術如Sanger 定序、qPCR、Nanostring、NGS 儀器平台、檢測試劑和生物資訊分析pipelines等。相容性平台越多越好。

 

品管標準通常由各個實驗室自行評估確立,但隨著時間的推移,品質管控的規範只會越來越重要且嚴謹。

目前常見的市售標準品主要有三家,分別為Horizo​​n Discovery、Seracare 和 AcroMetrix 的標準品,接下來就和各位簡要的介紹每一家標準品的特色。

 

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Horizo​​n Diagnostics:Horizo​​n Diagnostics 使用已知序列的親代細胞株,並利用獨有的基因編輯技術,將臨床相關的癌症基因突變囊括在標準品中,就像患者腫瘤基因突變一樣。單顆細胞的突變會被放大以備使用,且相同的親代細胞株會被設計成具有多個突變的細胞變異株。將正常親代細胞株與變異株混合,即可提供多種突變比例(AF)的標準品,不同比例AF的標準品會使用digital PCR 進行驗證。細胞株和標準品具有多種樣式可以選擇,包括:gDNA、FFPE 等。

 

Seracare:SeraCare 使用人工合成的plasmid DNA進行各種突變標準品的製備,且plasmid會帶有“Internal Quality Marker”,這個額外的 QC 標記是一個片段大小 6bp的 5'-ACATCG-3' 序列,會座落在突變位置附近 25bp 左右,並且無論是哪個方向的單股定序資料中,都可以分析到這個Internal Quality Marker。因此,這個marker和突變會具有相同的AF,可以做為評估實驗品質,並測定性能的品管分析方法。且所有品管品都有經過digital PCR 或 NGS技術驗證。

 

AcroMetrix:Thermo Fisher的AcroMetrix 產品採用MegaMix 技術,以GM24385 DNA基因體序列作為背景,添加多種突變基因序列,具有high-multiplex的特色。

AcroMetrix Oncology Hotspot Control 在GM24385細胞株的基因組加入500 多個單核苷酸變體 (SNV)、多核苷酸變體 (MNV)、插入和缺失突變。標準品突變已經過Sanger定序驗證。

 

總體而言, Horizo​​n 應用的基因工程方法,最接近地概括了真實腫瘤的基因組樣貌。然而,質體合成以及其他合成 DNA 的技術可以精確控制設計到標準品中的突變種類。 且SeraCare 的 6bp 5'-ACATCG-3'“Internal Quality Marker”,可以協助實驗室更精確的掌握實驗中所發生的品管問題,在QC流程中確認標準品本身有無異常。

 

參考資料:

Comparing reference standards for NGS cancer genomics

 

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The use of SeraCare and NGS validation challenges

日期: 2022年2月7日 (一)

時間: 16:30~18:00 PM

講者: Dr. Krystyna Nahlik

 

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作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員

 

延伸閱讀:

SeraCare實驗室品管調查-將NGS試驗標準化,提升檢測品質

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