每個人的個體差異,除了受到遺傳基因序列的影響以外,還有可能因DNA序列受到甲基化的化學修飾,而影響到後續表現出來的功能與性狀,這就是表觀基因體學(epigenomics)的一環DNA甲基化如果發生在基因的啟動子(promoter)序列,則這個基因的表現就會受到抑制。

national-cancer-institute-J28Nn-CDbII-unsplash.jpg
Photo by National Cancer Institute on Unsplash

 

目前研究已發現,細胞的正常發育、功能以及癌症等疾病,都受到DNA甲基化的調控。

 

做基礎醫學研究的朋友,有時會發現某個基因在某些情境下,有明顯被down regulation的現象,這個時候的future work除了參考一些文獻、鎖定一些轉錄因子(transcription factor)、進行DNA binding assayreporter assay、了解基因的啟動子是否受到某些轉錄因子調控以外;其實也可以往表觀基因體學的角度去思考,是否這個基因受到甲基化的調控喔!

 

到底該如何進行DNA甲基化的研究呢?

讓我們先一起了解一下整個甲基化的實驗原理吧!

目前市面上的甲基化研究都須先進行亞硫酸鹽反應 (bisulfite conversion)的前置實驗,這個化學反應原理是: 亞硫酸鹽可以讓DNA上的胞嘧啶(C)轉變為尿嘧啶(U);而如果DNA上的胞嘧啶(C)有受到甲基化的修飾 (5-甲基胞嘧啶),則不受亞硫酸鹽反應影響。這個差異性可以讓研究員得知DNA序列上甲基化的情形。

 

進行完亞硫酸鹽反應後,有哪些方法可以檢測DNA甲基化呢?

本篇文章為各位整理了8種常見的甲基化分析方法。可大致分為甲基化專一性PCR、及非甲基化專一性PCR的分析方法。

 

一、甲基化專一性PCR分析方法:
又分為兩種方法學,以下做簡單的介紹。
 

1. 甲基化專一性PCRmethylation-specific PCR, MSP
PCR primer直接設計在甲基化的位置(CpG site)上,會專一的只和甲基化、或非甲基化的序列互補。因此,實作上會針對這個甲基化序列設計兩對primer:一對是專一性的target 甲基化序列、另一對則是target非甲基化序列。這種方法對高密度CpG位點的區域非常實用MSP方法被認為是檢測單一位點甲基化敏感度最高的定性方法,可達到檢測出低至0.1%的甲基化比例,且實驗費用十分低廉。但傳統MSP方法的缺點是無法進行甲基化定量分析。
 

MSP-PCR相關延伸技術

(1) MethyLight是以MSP為基礎發展出來的定量測定。這個方法將甲基化及非甲基化專一性的primer加上螢光探針,簡單說就是QPCR版本的MSP技術,解決了MSP方法無法定量的問題。

(2) 有些研究員開發出溶解曲線分析法(Mc-MSP)。這個方法是同時放大原始序列和亞硫酸鹽處理後的序列,透過對不同峰值的比較可以得到定量關係。


2. 甲基化微陣列晶片 (methylation microarray)
例如illumina甲基化分析晶片,此方法主要用於對整個基因組甲基化程度的檢測。是利用目標CpG位點的雜交探針,分別與原始亞硫酸鹽處理後的序列互補。探針為亞硫酸鹽特異性的序列,以避免和反應不完全的DNA序列結合。


 

二、非甲基化專一性PCR分析方法:
非甲基化專一性的PCR primer會設計在和需要檢測的CpG site臨近的位置上,因此會同時放大甲基化和非甲基化的序列。這個類別的分析方式非常多元,且各自具有優缺點,主要有六大技術可以進行後續分析。

  1. Sanger定序 (Sanger sequencing)
    PCR結束後,所有未甲基化的胞嘧啶(C)都被轉換為胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(C)則轉換為腺嘌呤(G)。為了獲得足夠的定序資料靈敏度,定序前須將PCR放大的產物進行cloning (做成construct、塗盤養菌、挑colony),再抽colony DNA進行Sanger定序。這種方法費時費力,且通量較低,定量準確度取決於挑選的colony數量,誤差較大。目前較少人使用這個研究方法。

 

  1. 焦磷酸測序 (Pyrosequencing)
    PCR擴增後,焦磷酸測序可以檢測出被亞硫酸鹽作用而改變的CpG位點。利用CT的數量變化推算出甲基化的定量數值。這個技術的成本較高通量小定序長度約只有70 bp左右,不適合做長片段分析,也無法做大規模篩選的應用。不過若搭配等位基因專一性的primer進行PCR,就可以把單鏈和雙鏈的結果區分開來。這項技術對於基因銘印(gene imprinting)的檢測非常有效。

 

  1. 單鏈構象檢測 (single-strand conformation polymorphism, SSCA)
    SSCA為基礎所發展的甲基化檢測方式,其原理是:序列不同的DNA在未變性前會形成不一樣的次級結構,而使DNA在膠體電泳中移動時,會有不一樣的行進速率。在DNA甲基化檢測中,通常會有很多個胞嘧啶(C)被轉化成胸腺嘧啶(T),所以SSCA方法的敏感度很高。不過這種方法只能獲得一個區域的總體甲基化程度,無法得知具體位點的甲基化狀態。

 

  1. 高解析度解離分析 (high resolution melting HRM)
    HRM分析首先會將PCR產物用飽和螢光染料充分染色,所用的螢光染料只能嵌入並結合到dsDNA 上。雙鏈核苷酸(double strand DNAdsDNA)的熱穩定性會受其長度和鹼基組成的影響,因此在對PCR的擴增產物逐漸升溫過程中,dsDNA逐漸解離,隨著dsDNA結構逐漸減少,螢光強度也逐漸降低,從而得出樣本的溶解曲線(melting curve)。將溶解曲線和標準曲線對比就可以得到目的片段的甲基化情況。HRM方法可檢測低達 0.1% 的甲基化程度;不過這種方法只能獲得一個區域的總體甲基化程度,無法得知具體位點的甲基化狀態。 HRM 的優勢在於操作簡單分析時間短靈敏度高、具有高通量的特點。

 

  1. 單核苷酸引物擴增
    設計亞硫酸鹽特異性的primer,進行放大,並使PCR反應恰好停止在第一個CpG位點的C位。由於非甲基化位點已變為T、而甲基化位點仍是C,利用PCR產物中CT的比例可以進行甲基化定量分析。而分析CT比例有很多方法,可利用放射標記、螢光標記的ddNTP。此外,基質輔助雷射解吸/電離(MALDI高通量分析、高效液相色譜法(HPLC)等技術也能用於區分引物擴增產物。
     

    投影片5.JPG

    6.     鹼基特異性切割/基質輔助雷射解吸-電離法 (MassARRAY-MassCLEAVE)
    PCR primer中加入RNA聚合酶啟動子,將目的DNA片段轉錄為RNA片段。並使用RNase A切割CTU3’端。由於RNase AdTTPdCTP沒有切割效果,最後的結果是只有被甲基化的胞嘧啶的3’端被切割。通過MALDI-TOF質譜儀分析切割產物,可以得到甲基化定量資訊。這種方法可以用於高通量篩選,且分析片段可長達600 bp靈敏度、準確率高,具有高效和低成本的優點。投影片4.JPG


    豐技生技公司可以提供上述第5、第6項甲基化分析服務,後續我們會持續分享甲基化分析案例,以及常見分析問題給各位參考,千萬別錯過囉! 


    若有相關研究需求,歡迎與我們聯繫: (02) 2351-9800,或是留言與我們討論喔!
     

    研究人員線上檢測小工具: 基因檢測技術適性測驗
    市面上有太多基因檢測的分析方法,到底該如何在有限的研究經費內,選擇最適合自己的計劃、經濟實惠的研究技術呢? 來填寫線上適性測驗,就可以獲得我們推薦的分析結果報告囉!

    ★歡迎點選右側連結填答喔!  基因檢測技術適性測驗


    作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員

 

延伸閱讀:

●小知識分享● 怎麼做都無法得到甲基化PCR產物嗎? 換個方法試試!

 

    豐技生技 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()