分子生物學在目前藥物發展及生物醫學研究扮演非常重要的角色,基因檢測更是邁向個人化醫療的重要技術。

 

而基因檢測分析的成功率,取決於樣本核酸(DNA或RNA)的品質。
該如何掌控核酸樣本的質與量,是分析的一大關鍵!

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待分析的核酸可能分離自各式各樣的檢體,如:糞便、口腔棉棒、濾紙血片、石蠟包埋切片、組織、血液…等等。影響DNA質量大致可分為四大要素:
1. 檢體收集與處理、保存方式

2. 樣本的分解

3. 採取哪一種萃取、純化方法

4. 純化後的核酸品質檢測與保存

這些因素是影響核酸品質的關鍵! 分子生物學研究必須分離出高純度、高分子量的基因體DNA及完整之全長RNA,才能做完整且全面的分析,並提供相關樣本或外來病原之檢測與鑑別,或進行遺傳性疾病帶原、發病風險判定。

 

 

 

  • 錯誤的樣本採集過程與方法,可能使定量結果失準

進行基因表現量分析、或進行基因突變定量分析時,應該留意檢品收集過程可能會影響定量分析結果。例如:分析基因表現量時,萃取時要確認沒有genomic DNA汙染;想要採集糞便中的微生物DNA,後續純化就要考慮宿主腸道DNA汙染問題。病理切片中的腫瘤區塊大小,也會影響最終分析出的突變比率。

 

 

  • 核酸水解酶是破壞DNA/RNA穩定性的主要兇手!

DNA水解酶與RNA水解酶很容易在核酸萃取過程中釋出,且普遍存在於操作者的唾液及皮屑中。RNA水解酶較DNA水解酶穩定、需要高溫加熱10分鐘以上才能完全失活,且RNA水解酶通常不需要輔酶、只要微量的RNA水解酶汙染便足以破壞RNA,因此萃取RNA時需清潔環境與操作器具、戴口罩且更加小心,避免讓水解酶於萃取時摻入樣本中。

RNA因為容易被水解酶破壞,因此檢測難度較高,且容易因為檢體處理不當而產生假陰性的結果 (因為RNA結構被破壞使結果呈現陰性)。

 

 

  • 萃取純化DNA的方法

市面上萃取純化 DNA 的方法很多,大致有兩類:管柱萃取純化法(Column Purification)與試劑萃取純化法(Reagents Purification)。

 

試劑萃取純化法又分成兩種:有機溶劑萃取法與非有機溶劑萃取法。

每種萃取方法各有其優缺點,但由於有機溶劑具腐蝕毒性,且廢棄物處理較煩瑣、也較不環保,因此,目前大多使用非有機溶劑萃取方法進行核酸純化。

1. 管柱萃取純化法(Column Purification):先以陰離子類的清潔劑將細胞打破,並使蛋白質變性,以抑制 DNase 的活性,隨後加入蛋白分解酶 K(Proteinase K)讓 DNA 上的蛋白質解離,以增加 DNA 產率。接著將此DNA 混合物滴入純化管柱中,使DNA 與管柱中的過濾膜結合,最後再利用緩衝液將膜上的DNA 洗提流出。

2. 有機溶劑萃取純化法(Organic Sorvant Reagents Purification):利用有機溶劑(酚(Phenol)及氯仿(Chloroform))將細胞溶解,經過超高速離心使樣本分層,利用 DNA 會分佈於水相層的原理,將 DNA 分離出來,以酒精清洗沉澱,最後回溶於緩衝液中。

3. 非有機溶劑萃取純化法(Non-Organic Sorvant Reagents Purification):前半段原理與管柱萃取純化法相同,只是在加入蛋白分解酶 K使DNA解離後,接著以鹽類沉澱方法或是磁珠純化法去除蛋白質。萃取到的 DNA 以酒精沉澱法濃縮,並回溶於緩衝溶液中。

 

管柱萃取純化法與非有機溶劑萃取純化法目前市面上都有自動化萃取儀器,操作十分方便,並可針對後續的實驗設計選擇適當的萃取試劑,增加特殊樣本的專一性。

 

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  • 純化後的核酸品質檢測與保存

最終獲得核酸的品質,最好需評估純化後核酸之純度、序列完整性及數量,才能安排後續的實驗分析方式。例如,若後續想要進行NGS實驗分析,則DNA樣本若濃度不足、或是序列碎裂化太嚴重,可能會導致上機結果數據量不足,或數據豐度不夠而使結果失準 ;若想進行 qPCR實驗分析基因表現量,則RNA品質不佳、或是受到genomic DNA污染,則會使數據錯誤率增高、影響再現性。

 

 

 

如何評估萃取後的核酸品質呢? 該如何做好實驗品質管理呢? 

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作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員

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