取得DNA及RNA的樣品是所有分子生物分析的最上游技術,在先前的”核酸品質-決定基因檢測的可信度及資料豐度!”文章中,已經帶領各位了解有哪些因素會影響核酸萃取品質,以及目前有哪些核酸萃取方式。
而在這篇文章中,我們將分享如何以定量檢測評估DNA/RNA的樣本品質。
核酸的定性與定量
目前市面上有許多方法都可以評估核酸品質的優劣,可大致分為定性功能及定量功能檢測,包括:光譜分析、核酸片段電泳分析和探針技術。
這篇文章我們主要會針對幾個常見的核酸定量檢測做簡單的介紹!
核酸的定量方法:
一、紫外光吸光值分析(UV Absorption Analysis)
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測吸光値時,應以溶解該DNA樣品之相同溶液做為空白對照組。一般希望吸光讀値落在0.1至1.0之範圍內具適當(讀値-濃度)線性關係,當吸光値高於1.0時,會隨著吸光値增加而變得不線性;吸光值低於0.1(5 µg/mL之DNA)時,讀値之準確度則取決於分光光度計之品質與雜訊程度。
純DNA在260 nm附近之吸收波峰幾乎對稱; 在320 nm處吸光値為零;且在230 nm具有最小吸光値;而230 nm 之吸光值再次提升至220 nm。
接下來讓我們一同深入了解各個吸收光譜及數值所代表的意義吧!
1. A260 nm: 核酸最大吸收光在260 nm,但此數值無法區分DNA與 RNA。
2. A280 nm: 蛋白質及酚類物質的最大吸收光在280 nm,因此可利用計算 A260/A280之比率來估算核酸中蛋白質或酚類物質汙染量。在pH7-8.5 下,DNA的A260/A280理想比值為1.7~1.9,RNA為1.8~2.0。每毫升每毫克蛋白質在280 nm之吸光係數約為1,該數值取決於蛋白質其中之酪胺酸(Tyrosine, Tyr or Y)及色胺酸 (Tryptophan, Trp or W)含量。因蛋白質吸光値靈敏度較低,即使A260/A280之比率大於 1.8,仍可能存有大量蛋白質汙染。由於DNA吸光値變化 (△A/△λ)在波長280 nm處相對急遽,因此若分光光度計缺乏校正,可能導致測量不正確。
最後,須注意DNA吸光値及 A260/A280比率會依離子強度而有所不同,其差異高達30%。基因體DNA吸光值較高,而溶於純水中DNA之A260/A280比率會比 溶在緩衝液或鹽溶液之相同DNA為低。
3. A230 nm: 多肽、芳香基團、苯酚和碳水化合物的最高吸收光在230 nm,可利用A260/A230比值進行核酸樣品純度評估:理想的DNA和 RNA的A260/A230比值為2.0~2.5。若比值小於2.0,表示核酸樣本受到碳水化合物(醣類)、鹽類或有機溶劑污染,需要純化樣品。A230若為負值,則可能因為DNA 濃度過低,且樣本又有一些雜質干擾所致。若要解決這個問題,可以降低樣本稀釋倍率、或直接測量原液,以便校正A230的負值。
4. A320 nm或A340 nm: 可檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。正常的樣本數值應該接近0.0。如果不是,可能樣品中有懸浮物,需要純化樣品。
O.D.在不同種類核酸中代表不同的濃度,以雙股DNA來說,1 OD= ~50 µg/ml、RNA 1 OD = ~40 µg/ml、單股DNA 1 OD = ~33 µg/ml。依照以上之濃度,依算式可計算出核酸樣本的濃度 :
濃度 (µg/ml) = (A260 讀值 – A320 讀值) × 稀釋倍率 × *50µg/ml (for dsDNA)
*處可依據不同樣本類型作置換,RNA置換為40 µg/ml; ssDNA置換為33 µg/ml
二、螢光定量DNA與RNA
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1. 花青素染劑衍生物(cyanine dye derivatives):可專一性與核酸(DNA、RNA及寡核苷酸)產生交互作用,並且僅在結合時發出螢光。這個方法可使用螢光計或讀盤器進行測量。染劑的螢光靈敏度遠高於吸光値,因此當DNA濃度很低 (低至25 pg/mL)時,這些染劑提供了非常好的偵測效果。染劑必須防止光照,以避免光漂白作用。這類試劑通常會以小牛胸腺DNA和λ 噬菌體DNA作為校正物以建立標準曲線。
2. 優化的花青素染劑: 可以專一性的結合雙股DNA或單股RNA及寡核苷酸,因此,若在DNA製備過程中未刻意移除RNA時,此法是測量DNA之首選方法。蛋白質較不可能干擾這些染劑,但一些清潔劑以及苯酚會導致螢光逸失,因此應確認核酸萃取試劑對後續螢光測定之影響。
3. 雙苯甲醯亞胺螢光染劑: 如bisbenzimide,又稱Hoechst 33258也可測量DNA。這些染劑可與DNA雙股螺旋之小凹槽(minor groove)結合,且DNA序列中腺嘌呤(Adenine, A)或胸腺嘧啶(Thymine, T)核苷酸序列可提供此類染劑最佳的小凹槽結合空間,使螢光訊號強度與DNA序列相關,因此校正物DNA應具有與待測DNA相似的序列組成。這些染劑不如花青素染劑那麼靈敏,但比吸光値測量靈敏。使用此類染劑時,若要區分雙股DNA 與RNA,則分析人員應使用低染劑濃度及高離子強度;若要區分雙股DNA與單股DNA,則需要在低離子強度下進行分析。
還有一種定量方法是利用探針及QPCR技術進行定量分析。
這種方法同時具有定量及定性分析的功能,所謂的定性分析是指:核酸在長時間存放後很容易碎裂化,如何判定DNA序列的完整性,來增進後續定序分析的成功率呢?
之後我們將撰文為各位介紹,有哪些方法可以進行核酸的定性分析喔~
研究人員不知道該利用哪種技術進行序列分析實驗嗎?
歡迎聯絡我們,將有專人和您諮詢討論喔!
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作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員