癌症預後檢測-這是醫師針對癌症患者進行初步療程後,進行追蹤、治療的關鍵步驟。傳統的組織活檢採樣對患者而言,是一個非常痛苦的過程,尤其許多患者的腫瘤早已切除、且癌症患者治療後較為虛弱,這些腫瘤樣本不足、健康狀況等因素,常常導致傳統的預後篩查沒辦法精確的檢出患者的腫瘤突變狀況,而無法立即採取適當的治療。

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Photo by National Cancer Institute on Unsplash

 

為了解決上述問題,近年來有許多臨床癌症研究中心開始發展液態活檢的篩查技術,患者只需抽血,就可以進行癌症基因突變的篩查。

 

液態活檢(Liquid biopsy) 為何對癌症研究如此重要?

液態活檢的優勢包含了非侵入性、快速、精確、即時性四大特點。由於患者只需抽血就可以進行檢測,比起傳統的組織切片(手術開刀),對患者的負擔較輕微,可以更快速的取得樣本。此外,對腫瘤切除的患者而言,腫瘤組織樣本過少,會使組織切片無法精確的判斷預後情況。且傳統組織切片需要給患者較長時間的恢復期,無法在短期療程後,即時偵測預後狀況。

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延伸閱讀:  PCM液態活檢技術-搶在癌症復發前進行精準治療

 

然而,由於血液樣本中,游離的腫瘤DNA (ctDNA) 片段較短,因此液態活檢的檢測技術也面臨了許多挑戰:

  1. 游離腫瘤DNA (ctDNA) 偵測困難度高: 游離在血液中的癌症DNA都是小片段的DNA (小於200 bp),不容易被primer擴增、也很難以探針雜合(probe hybridization)的方式分離出來,且很容易有正常血球的基因組DNA (gDNA)被過量擴增,導致難以偵測腫瘤游離DNA的突變。

    以下圖為例,在這七種游離DNA片段中,由於斷點不一樣,導致正、反股primer無法同時黏合到DNA片段上,因此在下面這個案例中,傳統的PCR 擴增方式只能擴增出一種游離DNA(橘色框起部分)。
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    相反的,血液中存在的血球DNA為正常細胞的gDNA,片段較長、DNA品質較好,如果以傳統PCR的方式進行實驗,很容易擴增出正常細胞的DNA片段,導致游離的腫瘤DNA訊號被削弱、更加難以偵測。
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  2. 定序錯誤率高: 由於ctDNA 片段較短,因此在資料分析上,很容易因定序產生的雜訊而被誤判
     

該如何解決液態切片(liquid biopsy)檢測所面臨的挑戰呢?

ArcherDX 開發的LiquidPlex NGS分析試劑,可以輕鬆解決上述問題。在先前的 ArcherDX-伴隨式癌症NGS檢測新利器 文章中,曾為各位介紹過Anchored Multiplex PCRAMP™)化學技術,這個技術應用在ctDNA 中,也有不同的效果 !


LiquidPlex 可以專一性的放大腫瘤DNA訊號 !

LiquidPlex 相較於之前介紹過的 FusionPlex 技術,少了反轉錄 cDNA (RT) 以及序列片段化 (fragmentation)的步驟,操作時間更短,且可以精確放大 ctDNA 的訊號 :
實驗首先會將萃取的液態活檢 DNA 直接以接合 (ligation) 的方式,將 molecular barcode 與 universal primer site 一併接在 DNA 片段上。接著設計正股或反股的 PCR primer  (GSP1, GSP2 ),另一側利用 universal primer site 進行 nested PCR

由下方的序列示意圖可以看到,無論 ctDNA 的斷點在哪裡,正股或反股 PCR primer 永遠都可以和接合在DNA 序列上的 universal primer 配對,擴增出所有種類的 ctDNA片段。

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相反的,對於片段較完整的正常血球DNA,其擴增效率反而會變差。

怎麼說呢? 看下面這張示意圖就可以了解囉!
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上圖可以看到,正反兩股的 specific PCR primer 雖然可以擴增出短片段的產物,但因為 specific PCR primer上並沒有接 index 及 molecular barcode,因此這些序列資訊會被剔除。且正常血球細胞的DNA片段較長,specific PCR primer 和接合上的 universal PCR primer 距離太遠,無法有效的進行擴增反應。

由這個說明圖可以發現,AMP技術完美解決了傳統PCR技術所遇到的問題,避免了正常血球 genomic DNA訊號的背景值干擾。

 

ArcherDX 如何解決 NGS定序錯誤率的問題?

不管使用哪種NGS定序儀,次世代定序的技術本身就是會有約 0.5~1% 的定序錯誤率。這些錯誤的定序資料如果沒有好好過濾,可能會產生偽陽性的問題。

ArcherDX利用兩階段的資料分析,大幅減少定序錯誤率。首先,利用一開始黏接上的 molecular barcode,進行序列比對與篩選,並修正定序錯誤的定序資料。為了提高定序資料的專一性與敏感度,ArcherDX 的分析軟體進一步利用統計方法 mDAF 95 (minimal detectable allele frequency at 95 confidence),計算低頻突變的定序資料是否落在 95%信賴區間之內,藉此排除定序的雜訊。

ArcherDX

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LiquidPlex試劑套組目前收錄了28個臨床solid tumor常見的突變基因,整個試劑可以彈性的客製化增加或減少基因數量,且無論分析的基因數目多寡,ArcherDX的分析技術都可以維持足量的定序深度、精確的突變基因、高品質的定序結果。

ArcherDX 的 LiquidPlex 產品為癌症液態活檢篩查提供更好的分析品質,並提供醫師精確的用藥指引 !

豐技生技為ArcherDX的總代理,若想了解更多Liquidplex 產品說明,歡迎到 豐 技 官 網 閱讀更多LiquidPlex產品介紹!

 

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歡迎點選下面連結收看LiquidPlex 相關研討會影片:
ArcherDX Liquid Biopsy Solutions: LiquidPlex™ and Personalized Cancer Monitoring (PCM™)

LiquidPlex 官網介紹:
Customizable liquid biopsy panels with results in as little as 3 days

 

 

作者: 林宇馨 / 豐技生技產品專員

 

延伸閱讀:

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