●基因檢測● 如何評估DNA樣本的品質?-核酸定量檢測 @ 豐技生技's Blog

取得DNA及RNA的樣品是所有分子生物分析的最上游技術，在先前的”核酸品質-決定基因檢測的可信度及資料豐度!”文章中，已經帶領各位了解有哪些因素會影響核酸萃取品質，以及目前有哪些核酸萃取方式。
而在這篇文章中，我們將分享如何以定量檢測評估DNA/RNA的樣本品質。

核酸的定性與定量

目前市面上有許多方法都可以評估核酸品質的優劣，可大致分為定性功能及定量功能檢測，包括：光譜分析、核酸片段電泳分析和探針技術。

這篇文章我們主要會針對幾個常見的核酸定量檢測做簡單的介紹!

核酸的定量方法:

一、紫外光吸光值分析（UV Absorption Analysis）
相關產品包括: 傳統比色管分光光度計、NanoDrop、BiospecNano…等。
測吸光値時，應以溶解該DNA樣品之相同溶液做為空白對照組。一般希望吸光讀値落在0.1至1.0之範圍內具適當（讀値-濃度）線性關係，當吸光値高於1.0時，會隨著吸光値增加而變得不線性；吸光值低於0.1（5 µg/mL之DNA）時，讀値之準確度則取決於分光光度計之品質與雜訊程度。

純DNA在260 nm附近之吸收波峰幾乎對稱；在320 nm處吸光値為零；且在230 nm具有最小吸光値；而230 nm 之吸光值再次提升至220 nm。

「biospec nano」的圖片搜尋結果"

接下來讓我們一同深入了解各個吸收光譜及數值所代表的意義吧!

1. A260 nm: 核酸最大吸收光在260 nm，但此數值無法區分DNA與 RNA。

2. A280 nm: 蛋白質及酚類物質的最大吸收光在280 nm，因此可利用計算 A260/A280之比率來估算核酸中蛋白質或酚類物質汙染量。在pH7-8.5 下，DNA的A260/A280理想比值為1.7~1.9，RNA為1.8~2.0。每毫升每毫克蛋白質在280 nm之吸光係數約為1，該數值取決於蛋白質其中之酪胺酸（Tyrosine, Tyr or Y）及色胺酸 (Tryptophan, Trp or W)含量。因蛋白質吸光値靈敏度較低，即使A260/A280之比率大於 1.8，仍可能存有大量蛋白質汙染。由於DNA吸光値變化（△A/△λ）在波長280 nm處相對急遽，因此若分光光度計缺乏校正，可能導致測量不正確。
最後，須注意DNA吸光値及 A260/A280比率會依離子強度而有所不同，其差異高達30％。基因體DNA吸光值較高，而溶於純水中DNA之A260/A280比率會比溶在緩衝液或鹽溶液之相同DNA為低。

3. A230 nm: 多肽、芳香基團、苯酚和碳水化合物的最高吸收光在230 nm，可利用A260/A230比值進行核酸樣品純度評估：理想的DNA和 RNA的A260/A230比值為2.0~2.5。若比值小於2.0，表示核酸樣本受到碳水化合物（醣類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。A230若為負值，則可能因為DNA 濃度過低，且樣本又有一些雜質干擾所致。若要解決這個問題，可以降低樣本稀釋倍率、或直接測量原液，以便校正A230的負值。

4. A320 nm或A340 nm: 可檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。正常的樣本數值應該接近0.0。如果不是，可能樣品中有懸浮物，需要純化樣品。

O.D.在不同種類核酸中代表不同的濃度，以雙股DNA來說，1 OD= ~50 µg/ml、RNA 1 OD = ~40 µg/ml、單股DNA 1 OD = ~33 µg/ml。依照以上之濃度，依算式可計算出核酸樣本的濃度 :
濃度 (µg/ml) = (A₂₆₀ 讀值 – A₃₂₀ 讀值) × 稀釋倍率 × *50µg/ml (for dsDNA)
*處可依據不同樣本類型作置換，RNA置換為40 µg/ml; ssDNA置換為33 µg/ml

二、螢光定量DNA與RNA
相關產品包括: Qubit, Quantus™…等

1. 花青素染劑衍生物（cyanine dye derivatives）:可專一性與核酸（DNA、RNA及寡核苷酸）產生交互作用，並且僅在結合時發出螢光。這個方法可使用螢光計或讀盤器進行測量。染劑的螢光靈敏度遠高於吸光値，因此當DNA濃度很低（低至25 pg/mL）時，這些染劑提供了非常好的偵測效果。染劑必須防止光照，以避免光漂白作用。這類試劑通常會以小牛胸腺DNA和λ 噬菌體DNA作為校正物以建立標準曲線。

2. 優化的花青素染劑: 可以專一性的結合雙股DNA或單股RNA及寡核苷酸，因此，若在DNA製備過程中未刻意移除RNA時，此法是測量DNA之首選方法。蛋白質較不可能干擾這些染劑，但一些清潔劑以及苯酚會導致螢光逸失，因此應確認核酸萃取試劑對後續螢光測定之影響。

3. 雙苯甲醯亞胺螢光染劑: 如bisbenzimide，又稱Hoechst 33258也可測量DNA。這些染劑可與DNA雙股螺旋之小凹槽（minor groove）結合，且DNA序列中腺嘌呤(Adenine, A)或胸腺嘧啶(Thymine, T)核苷酸序列可提供此類染劑最佳的小凹槽結合空間，使螢光訊號強度與DNA序列相關，因此校正物DNA應具有與待測DNA相似的序列組成。這些染劑不如花青素染劑那麼靈敏，但比吸光値測量靈敏。使用此類染劑時，若要區分雙股DNA 與RNA，則分析人員應使用低染劑濃度及高離子強度；若要區分雙股DNA與單股DNA，則需要在低離子強度下進行分析。